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    切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

    點擊次數:2318  更新時間:2015-08-10

    抗體稀釋液

        其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可,但的抗體稀釋液中除PBS成份外,還加了*防腐劑、BSA穩定劑等組份,對抗體的多次回收利用較好。正因為這種原因,我一直用國產的抗體稀釋液,一段時間在更換新抗體稀釋液時實驗結果出現了陰性結果(提示可能一抗沒有結合),zui后從抗體濃度和孵育時間、封閉時間等原因排除后,發現是新抗體稀釋液的PH值偏酸,而使抗原抗體反應不佳,終而出現假陰性結果。

    切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

        為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當地加強清洗(延長時間和增多次數)尤為重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
    注意:

    ①單獨沖洗,防止交叉反應造成污染。

    ②溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;

    ③沖洗的時間要足夠,才能*洗去結合的物質。

    ④PBS的PH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓,當時我買的抗體稀釋液偏酸,結果背景一片黃(未見特異性染色),建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。(中性及弱堿性條件(PH7-8)有利于免疫復合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強度有利于免疫復合物的形成,而高離子強度則有利于分解)

    DAB顯色

        背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的,主要由顯微鏡下控制顯色時間,到出現特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗;DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就出現很深的棕褐色,這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長,需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間;此外,若很短時間就出現背景很深,還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全,需要延長封閉時間;DAB顯色時間很長(如超過十幾分鐘)才出現陽性染色,一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短(一抗4℃);另一方面就是封閉時間過長。

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